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SMYD5 catalyzes histone H3 lysine 36 trimethylation at promoters. Nat Commun. 2022

来自浙大Fang Dong团队，研究甲基转移酶催化组蛋白调控基因转录的具体机制。

结果

H3K36me3富集于启动子区域

通过CUT&Tag技术发现H3K36me3富集于启动子区域，并且不依赖Setd2（Setd2被认为参与H3K36me3与gene body的结合）。

不太理解a图中的gene body信号差异（WT v.s. Setd2 KO）为什么没有后面两种方法明显。是因为CUT&Tag时的H3K36me3与靶基因body连接不够紧密？

“H3K36me3富集于启动子区域”可能是假阳性现象，作者就以下混杂因素展开实验来论证：

• 抗体非特异性占位（2个抗体）

• 测量方法（CUT&Tag; N-Chip-Rx；X-Chip-Rx；前者是新方法，后两种是常规方法）

• Tn5转座体（Tn5 transposome）随机靶向开放性染色质区域：通过RNA-Seq + ATAC-seq的数据，发现H3K27me3和K3K9me3的高表达基因的启动子区域其实并没有非特异性富集，间接证明了这种猜想的存在性较弱或不可能。

• Pol II占位（使用Flavopiridol、THZ1或高盐将Pol II从染色质中移除）；

系列实验表明H3K36me3富集于启动子区域，且受Pol II的调控。

SMYD5促进H3K36me3甲基化从而诱导其在启动子区域募集

研究者用简单粗暴的方法进行筛选，即通过限定条件初步锁定30余个侯选甲基转移酶，分别KO之，然后测量它们对H3K36me3在启动子区域募集程度（Index）的改变：

图很简单，工作量却不小

双sgRNA-ko细胞株共同确定了Smyd5这个甲基转移酶。研究者对Symd5影响H3K36me3启动子富集的结果进行了单独展示：

为了确定SMYD5甲基化H3形成H3K36me3，作者需要排除SMYD5是否影响H3K36me3的总表达水平。结果表明Smyd5不影响H3K36me3的总体表达：

为了明确SMYD5甲基化H3K36的效应及具体位置（重组核心核小体 or 组蛋白八聚体），作者通过以下实验论证观点：

• histone methyltransferase assay（HMT实验）

• HMT实验 + H3K36M mutant octamers。这里运用了半定量的实验设计。

• ESI-TOF质谱分析检测3个甲基的信号：

SMYD5定位在启动子甲基化H3K36me3并调节基因表达

前面论证完H3K36me3在启动子的富集，所以还要看看SMYD5是否在可以在启动子区域富集。毕竟SMTD5要催化H3K36，物理位置应当具有一致性。

首先，排除FLAG标签对H3多种蛋白的影响（即不影响 H3K36me2的含量）：

回复实验（WT vs. OE vs. KI）表明Smyd5可在启动子区域募集：

Smyd5在启动子区域募集的信号强度与H3K36me3在启动子区域募集的信号强度成正比（WT vs. OE/KI; KO vs. KO-OE/KI）：

OE/KI的半定量实验：

H3K36me3在启动子区域募集的信号强度与基因表达（Smyd5-KO/WT）下调程度成反比？

We observed a strong positive correlation (R = 0.29) between the changes in downregulated genes and H3K36me3 levels and a strong negative correlation (R = −0.28) between the alterations in upregulated genes and H3K36me3 levels. 这说明了什么？

Pol II与SMYD5互作并影响SMYD5催化H3K36me3的活性

前面讲完H3K36me3和SMYD5，要讲与Pol II的相互作用。机制更加深入。

co-IP互拉：拉Smyd5、FLAG-Smyd5或拉Pol II，证明Pol II与SMYD5互作。

THZ1（CDK7 inhibitor，Remove Pol II from promoters）可影响Pol II与SMYD5的互作：

GST tagged Pol II CTD was purified and then phosphorylated by the CDK7-Cyclin H complex. 发现Smyd5只与CTD-p而不与CTD互作：

Pol II C-terminal domain (CTD)，即Pol II C-末端结构域

通过HMT实验证明SMYD5甲基化H3K36me3的过程依赖CTD-p：

SMYD5的C端具有甲基转移酶活性

明确分子功能的有效结构域。分子医学研究者的常规操作。

研究者设计了不同的SMYD5片段进行实验：C-terminal domain-deleted SMYD5 (SMYD5-ΔC), and N-terminal domain-deleted SMYD5 (SMYD5-ΔN)

发现SMYD5失去C端后与H3成分的结合能力变弱：

SMYD5失去C端后甲基转移酶活性也变弱：

SMYD5失去C端后，与CTD/CTD-p结合能力变弱，SMYD5的CTD依赖的甲基转移酶活性变弱：

过表达Smyd5恢复H3K36me3和基因表达

回复实验。分子医学常规操作。

首先，排除过表达Smyd5对整体H3/H4水平没有影响：

Smyd5-full和Smyd5-ΔC均可与启动子区域相结合，也不影响H4组蛋白在启动子区域的结合：

但Smyd5-ΔC（缺乏C端）时无法恢复基因表达：

动物实验表明Smyd5具有促肝癌作用

基于前面的研究，这一节比较顺理成章。无特殊。

小结

研究者首先发现了一个现象：H3K36me3在基因启动子区域具有富集现象（既往认为H3K36me3只在基因体富集），这是本文的主要创新点。基于对研究对象和领域的深刻理解，研究者在前面的结果里大量运用了控制混杂因素的论证方法，让整个论证过程更加严谨和丰满。后面进一步挖掘H3K36me3在基因启动子区域富集的具体调控机制，发现了SMYD5这一关键调控因子。至于后续确定SMYD5调控H3K36me3的过程和具体部位，使用的都是该领域较经典的实验设计或方法。体内实验的设计与机制探讨的逻辑是相一致的，也比较常规。