概述

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Coordinated transcriptional and catabolic programs support iron dependent adaptation to RAS-MAPK pathway inhibition in pancreatic cancer. Cancer Discov.

加利福尼亚大学旧金山医学院Rushika M Perera团队

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同期有一篇类似的文章：NCOA4-mediated ferritinophagy is a pancreatic cancer dependency via maintenance of iron bioavailability for iron-sulfur cluster proteins

ferritinophag 铁自噬;

技术

Inhibitors/drugs

• BafA1：巴佛洛霉素A1，大环内酯类抗生素，是一种知名的自噬晚期阶段抑制剂，可阻断自噬体与溶酶体的融合，并抑制培养细胞溶酶体中的酸化和蛋白质降解。在本文中，BafA1作为是特异、可逆的V-ATPase抑制剂用于诱导急性溶酶体抑制。由于BafA1在体内试验中的毒性较大，FDA目前只批准chloroquine (CQ)作为临床实验中的自噬抑制剂。
• Trametinib：在本文中，Trametinib一般统称为MEKi。曲美替尼是吡啶并嘧啶（作为其二甲基亚砜加成化合物）药物，一种口服生物可利用的丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAP2K；MAPK/ERK 激酶；MEK）1 和 2 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，曲美替尼特异性结合并抑制 MEK 1 和 2，从而抑制各种癌症中生长因子介导的细胞信号传导和细胞增殖。 MEK 1 和 2，双特异性丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶，通常在各种癌细胞类型中上调，在调节细胞生长的 RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路的激活中起关键作用。

Experiments

• In-gel activity assay for Complex I activity in purified mitochondria from KP4 cells
• Blue native PAGE analysis of purified mitochondrial fractions
• Oxygen consumption rate of individual mitochondrial respiratory complex (complexes I-III and II-III)

Molecules

• LAMP2: 即Lysosomal Associated Membrane Protein 2，溶酶体相关膜蛋白2。LAMP2在伴侣介导的自噬中发挥重要作用，该过程介导蛋白质的溶酶体降解以响应各种压力，并作为具有长生物半衰期的蛋白质正常周转的一部分。通过结合目标蛋白（例如 GAPDH 和 MLLT11）并诱导目标蛋白在溶酶体降解来发挥作用。在响应饥饿的溶酶体蛋白降解中发挥作用（通过相似性）。自噬过程中自噬体与溶酶体融合所必需的 。缺乏 LAMP2 的细胞表达正常水平的 VAMP8，但无法在自噬体上积累 STX17，这是自噬体和溶酶体之间缺乏融合最可能的解释。自噬体内容物正常降解所必需的。需要通过其在溶酶体蛋白降解中的功能有效地介导 MHCII 介导的外源抗原呈递；由内体/溶酶体区室中的蛋白酶产生的抗原肽被新生的 MHCII 亚基捕获。不需要有效的 MHCII 介导的内源性抗原呈递 。
• NCOA4：Ferritin is degraded by autophagy-dependent capture via the adaptor NCOA4, a process referred to as ferritinophagy (36, 37). 本文中，NCOA4是铁自噬受体，通过阻断NCOA4达到抑制铁自噬的作用。

预备知识

• KRAS-MAPK通路在胰腺导管癌中广泛激活，但KRAS-MAPK抑制仍面临耐药问题。
• 近期有研究表明KRAS/MEK/ERK抑制可诱导适应性的自噬反应增强从而诱导耐药，但具体的机制仍不明确。
• 研究者前期研究表明主转录因子中的小眼转录因子E(MiT/TFE)家族的MITF、TFE3、TFEB的持续激活可诱导高水平的自噬和溶酶体活性，它们均属于MYC超家族，在结构上有某些相似性。抑制MiT/TFE可降低溶酶体和自噬活性，并显著抑制肿瘤生长。
• 本研究主要发现了c-MYC通过MiT/TFE蛋白调控PDA的自噬和溶酶体相关基因。KRAS-MAPK通路受抑制后，c-MYC活性下调，导致MiT/TFE介导的铁自噬（自噬类型之一）和溶酶体信号上调，从而介导PDA对KRAS-MAPK抑制剂耐受。

结果

MEKi诱导自噬和溶酶体基因转录上调的过程依赖TFEB

这一段基本上是在前人研究的基础上，进一步确定“MEKi——自噬”和“MEKi——MiT/TFE——自噬/溶酶体相关基因”的基本调控框架。

MEKi抑制可促进自噬体蛋白LC3B表达上调和自噬流增加：

MEKi促进Lysosome相关基因的表达：

MEKi促进自噬-溶酶体相关蛋白LAMP2（自噬体与溶酶体融合的关键蛋白之一）的表达：

Western Blot和RT-qPCR实验证明MEKi促进自噬和溶酶体相关基因表达，并且此过程依赖TFEB：

由于目标蛋白是核蛋白，Western中检测了核/质分离的样本

MYC下调促进溶酶体基因表达上调

基本上确立“MEKi——MYC——MYC靶基因”的调控框架

MEKi可抑制MYC下游靶基因的表达：

多种实验证实MEKi抑制MYC表达：

观察cMYC-mRNA/protein水平；观察核/质的分布

类器官培养和刺激实验也表明MEKi抑制MYC表达：

在3d培养组织中进一步验证

MYC knockdown后，溶酶体基因表达上调；MYC knockdown的情况下，MEKi对溶酶体基因表达上调的幅度变小，这表明MEKi上调溶酶体基因的过程较大程度上依赖MYC：

MEKi诱导溶酶体基因启动子处转录因子的占位变化

本部分主要阐明MYC与MiT/TFE对转录因子的调控具有“此消彼长”的关系。MYC信号弱了，MiT/TFE（主要是基于TFE3的实验）就跟上。

通过通路富集分析发现受转录因子TFE3和MYC调控的下游基因有很多重叠之处：

通过ChIP-seq进一步表明MEKi可使MYC与基因TSS的结合减弱，但不影响 TFE3与基因TSS的结合（以ATG3/CTSD/CTSA）：

Chiq-Seq+PCR实验表明MEKi处理后TFE3与靶基因TSS结合程度更高（H）; 通路富集分析表明MEKi处理后TFE3靶基因表达上调的部分显著富集于溶酶体和自噬相关通路；蛋白组学数据表明MEKi可抑制MYC靶基因的表达并上调MiT/TFE靶基因的表达。

J图怎么感觉与前面的内容有点重复？

MEKi诱导了铁自噬

本部分主要是明确“MEKi——溶酶体/铁自噬信号上调”的研究框架

提纯溶酶体后，发现MEKi可诱导溶酶体蛋白FTH1和FTL表达上调；通过co-IP实验表明MEKi促进了FTH1/FTL与溶酶体结合：

更近一步地，通过免疫荧光观察到MEKi促进溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）与FTL结合；溶酶体抑制剂（BafA1）可增强溶酶体与FTL的结合？

erroOrange iron dye染色表明MEKi促进了铁积聚，但溶酶体抑制剂可抑制这一效应，说明MEKi诱导铁自噬的过程依赖溶酶体活性：

FAS、DFO分别充当阳性、阴性对照

体内外实验证明MEKi可促进FTH1与FTL的总体表达水平：

实验表明MEKi降低膜转铁受体Transferrin receptor (TfR1) 含量和Ferroportin 铁输出蛋白 (FPN）的含量，表明MEKi抑制铁原子的外排：

MEKi增强了线粒体铁硫簇蛋白水平、复合物活性和呼吸作用

背景：细胞质不稳定铁池 (labile iron pool, LIP) 里面的氧化还原活性铁用于合成血红素和 ISC 。 ISC 是线粒体电子传递链 (ETC) 的复合体 I、II 和 III 中几种蛋白质的必需辅助因子，而复合体 II、III 和 IV 中的其他蛋白质含有血红素。所以，此部分也是自然而然想到的，主要是为了深化机制研究。

本部分主要是为了证明MEKi对线粒体活性的影响。

全细胞蛋白组学数据显示MEKi诱导多个线粒体铁硫簇蛋白（Iron-sulfur cluster, ISC）表达上调，随后的全细胞和线粒体提纯物的Western blot分析也进一步佐证：

In-gel activity assay表明MEKi促进线粒体呼吸复合物I的活性和ISC蛋白Aconitase 2的活性：

MEKi促进KP4细胞线粒体呼吸复合物I-III/II-III的耗氧率（Oxygen consumption rate, OCR）：

Oxygen consumption rate of mitochondrial respiratory complex using seahorse in KP4 cells treated with DMSO or MEKi.

阻断铁自噬或溶酶体会损害线粒体活性和细胞活力

NCOA4 nuclear receptor coactivator 4; 以配体依赖性方式与雄激素受体相互作用以增强其转录活性; 在本文中，NCOA4是铁自噬受体；

exogenous iron, FAC, 外源性铁; Chloroquine, 氯喹, CQ; iron chelator, DFO铁清除剂; FAC诱导铁自噬，DFO抑制铁自噬，两者分别是阳性/阴性对照。

除了表明线粒体活性、ISC上调等MEKi相关效应依赖铁自噬外，还初步展示MEKi+铁自噬抑制的联合治疗有协同效应

实验表明MEKi介导的ISC上调依赖铁自噬（通过干扰NCOA4控制铁自噬）；类似的，自噬抑制剂氯喹也可取消MEKi介导的ISC上调：

同时，氯喹也可抑制MEKi介导的复合物I活性增强，并且FAC使用可以回复氯喹介导的复合物I活性抑制效应：

NCOA4 knockdown的情况下，MEKi无法诱导KP4细胞OCR增加，甚至基础OCR还有所下降，这表明MEKi诱导KP4细胞OCR增加的效应依赖铁自噬：

MEKi联合shNCOA4可诱导KP4细胞的凋亡标记物上调（Cleaved-PARP是细胞凋亡标志之一），但此效应可通过补充外源性铁阻断：

后续的平板克隆实验也进一步表明MEKi+shNCOA4介导细胞凋亡的效应可被外源性铁阻断：

应激后自噬-溶酶体特征广泛激活并与MYC活性负相关

在其它肿瘤的细胞株和数据集里面验证结论的普遍性

在肠癌细胞株和NSCLC细胞株中进一步验证MEKi可上调溶酶体基因并下调MYC靶基因：

基于TCGA的胰腺癌、肠癌、肺癌数据库的分析表明MYC通路激活水平与溶酶体通路激活水平呈负相关：

小结

本研究的主要创新点在于发现MiT/TFE调控铁代谢在MEKi诱导自噬-溶酶体活性增强的过程中发挥重要作用。虽然还没看到文章的补充材料，但文章整体框架比较简单（至少比文献精读 第2期要简单1个数量级），也没有很复杂的动物实验。论点论证的过程中，实验设计比较简洁，并不着重通过控制多种混杂因素来增强论证；实验方法比较常规。作者发现MEKi诱导铁自噬的过程后，基于Fe2+——线粒体代谢的基本线索展开了后续MEKi对线粒体活性影响的相关研究，逻辑过程自然不突兀，也具有启发性。整体上，研究机制广度要比深度更加突出些。当然，作者最后也对研究结论在泛癌层面进行探究和讨论，不过只是浅尝辄止，这算是本研究中较弱的一环。

本研究最大的亮点是具有较强的临床转化能力。与《文献精读 第2期 靶向cGAS-STING-IL6治疗CIN肿瘤》类似，本文也提出了一种可行性很强的临床治疗策略——抑制自噬有望用于治疗KRAS/MEK/ERK抑制剂耐受的胰腺癌患者。无论是Trametinib还是氯喹都是FDA批准的药物（至少在临床试验的层面上），“Trametinib+氯喹”联合疗法或可让PDA患者获益。但本文又不止于此——通过表明铁自噬在MEKi耐药中的关键作用，为未来靶向铁自噬治疗KRAS/MEK/ERK抑制剂耐受胰腺癌患者奠定研究基础。也许这也是它凭借相对普通的实验论证却可以在Cancer Discov这种顶刊中发表的主要原因之一；从比较功利的角度上看的话，这是一个性价比很高的研究。

从最近看的两篇Nature大作，我发现它们的基调是创新点不多，但论证过程详尽，转化潜力巨大。当然，现实中不乏一些研究可能会一下子将前沿推进很远，但那种研究往往是可遇而不可求的。大多数的研究（甚至是Nature级别的研究）都是一点点推进科学发展和进步的，没有浮夸和冒进。相较于繁杂的机制探讨和论证，研究者贴近临床的“接地气”的朴实的研究思维让我更加印象深刻。