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论文：cGAS–STING drives the IL-6-dependent survival of chromosomally instable cancers. Nature. 2022

From 荷兰-格罗宁根大学医学中心-欧洲老年生物学研究所的Floris Foijer团队.

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此文还有Nature评论：Targeting cancers with chromosome instability. Nat Rev Drug Discov. 2022

Received: 1 September 2021；Accepted: 10 May 2022.

技术

Cell lines

• BT549：TNBC细胞株之一
• KIF2C (CIN low ) or dnMCAK (CIN high ) WT: 在本文中，KIF2C细胞一般指高表达MCAK（也称为KIF2C）的TNBC 4T1细胞，而dnMCAK细胞一般指高表达无功能MCAK突变型的TNBC 4T1细胞 。

inhibitors/drugs

• WEE1 inhibitor AZD1775 / MPS1 inhibitor reversine: 诱导微核形成并激活cGAS-STING通路。在本研究中，作者发现AZD1775治疗对BT549-WT也有一定的杀伤效应；但Reversine对BT549-WT则无明显杀伤效应，相对而言是比较接近临床的CIN诱导剂（毕竟临床观察到的CIN肿瘤肯定是正常生长状态）。
• Tocilizumab: 托珠单抗；interleukin-6 receptor (IL-6R)抑制剂
• RU.521: RU.521是cGAS（环状GMP-AMP合酶，cGAMP合酶）的小分子抑制剂。 cGAS 是胞质双链 DNA (dsDNA) 的主要传感器。cGAS通过STING和TBK1激活 I 型干扰素 (IFN)。
• UMK57 ：详见ref。UMK57通过增强MCAK 的活性抑制CIN癌细胞中的染色体错误分离。亚致死剂量的UMK57 会在有丝分裂过程中破坏动粒-微管 (k-MT) 附件的稳定性，从而提高染色体分离保真度。令人惊讶的是，UMK57 处理的癌细胞中染色体错误分离会在几天内反弹。这种快速复发是由超稳定k-MT附件的Aurora B信号通路的改变驱动的，并且在 UMK57 去除后是可逆的。在本文中，UMK57主要用于在dnMCAK细胞中提高有丝分裂保真度（mitotic fidelity）。在较低剂量时（<0.1μM），UMK57可通过抑制CIN增强cGAS^KO/STAT3^KOdnMCAK细胞的活力，这反证了CIN和cGAS信号抑制可产生合成致死性效应（这个说法可能不太严谨，但理是这个理, Extended Data Fig. 5g）：

Animals

Lck-Cre品系可在胸腺细胞中特异性重组loxP侧翼等位基因

• Msh2 ^–/–(eT) mice: 产生非CIN型急性T细胞性白血病（T-ALL）
• Mad2 ^fl/fl ;Trp53 ^fl/fl ; Lck-cre mice用于构造CIN型急性T细胞性白血病
• Mps1 ^fl/fl ;Trp53 ^fl/fl ; Lck-cre mice用于构造CIN型急性T细胞性白血病

Experiments

• 有丝分裂异常定量：Quantification of mitotic abnormalities
• DNA纤维检测：DNA fibre assay；反映replication stress。可看这里了解详细。
• H2B–GFP–T2A–CENPB染色：For the quantification of kinetochores（动粒, 有丝分裂和减数分裂期间将染色体连接到微管聚合物上） in micronuclei, BT549 cells expressing histone H2B–GFP–T2A–CENPB (Centromere Protein B, 着丝粒蛋白B)–mCherry（着丝粒阳性微核） were seeded on a four-section imaging chamber and treated with 250 nM reversine or 500 nM AZD1775 24 h before imaging.

预备知识

cGAS-STING信号通路

Representative ref: DNA sensing by the cGAS–STING pathway in health and disease. Nat Rev Genet.2019. full.pdf.remote

Micronuclei 微核

Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 2015

NF-kappa-B信号通路

参考并引用自：https://www.cellsignal.cn/pathways/nfkb-signaling-pathway。本文的研究涉及到经典与非经典两种NF-kappa-B通路

NF-kappa-B 是由含有 Rel 样结构域的蛋白质 RELA/p65、RELB、NFKB1/p105、NFKB1/p50、REL 和 NFKB2/p52 形成的同源或异源二聚体复合物。异二聚体 RELA-NFKB1 复合物可能是最丰富的一种NF-kappa-B二聚体。二聚体在其靶基因的DNA 中的kappa-B位点结合，并且各个二聚体对不同的 kappa-B 位点具有不同的偏好，它们可以以可区分的亲和力和特异性结合这些位点。不同的二聚体组合分别充当转录激活剂或阻遏剂。

在经典信号通路中，NF-κB/Rel 蛋白与 IκB 蛋白结合并受到其抑制。促炎细胞因子、脂多糖 (LPS) 、生长因子以及抗原受体激活一个 IKK 复合体（IKKβ、IKKα 和 NEMO），后者将 IκB 蛋白磷酸化。IκB 磷酸化导致其自身泛素化以及蛋白酶体降解，释放 NF-κB/Rel 复合体。活性 NF-κB/Rel 复合体进一步由翻译后修饰（磷酸化、乙酰化、糖基化）作用激活，并转运入胞核，在核内单独或联合其他转录因子，包括 AP-1、Ets 和 Stat，并共同诱导靶标基因表达。

在非经典NF-κB 通路中，NF-κB2 p100/RelB 复合体在细胞浆中失活。信号转导通过受体的一个子集，包括 LTβR、CD40 和 BR3，激活激酶 NIK，而 NIK 反过来激活 IKKα 复合体，后者将 NF-κB2 p100 的 C 端残基磷酸化。NF-κB2 p100 的磷酸化导致其自身泛素化，并且蛋白酶体加工为 NF-κB2 p52。这样可产生具备转录能力的 NF-κB p52/RelB 复合体，并转运入胞核，再诱导目的基因表达。

结果

cGAS-STING信号缺失可抑制CIN型TNBC增殖

发现现象

MPS1/WEE1抑制诱导染色体不稳定性（CIN）的过程中，BT549细胞携带有丝分裂异常事件的比例会大大增加（a）。由于染色体不稳定性的增加，微核（micronuclei）的形成也很有可能大幅增加，相关的实验也证实了这一点（b-c）。与MPS1抑制（Reversine）不同，WEE1抑制（AZD1775）产生的微核着丝粒较少（d-e）并导致更大的复制压力（replication stress）：

由于Reversine诱导BT549细胞CIN的过程可促进微核产生，因此研究者联想到胞浆DNA感受经典通路——cGAS-STING信号很可能也有所增强，这个猜测也得到了实验证实：

评估靶点

为了进一步评估cGAS-STING信号激活在CIN细胞中的重要性，研究者构建cGAS KO细胞株，并发现Reversine诱导CIN对cGAS KO BT549细胞的cGAS-STING信号强度无明显影响，其中包括胞内外cGAMP、：

STING的表达水平：

cGAS-STING下游——IRF3, STAT1 or STAT3的磷酸化：

这几个结果综合反映了cGAS KO株的cGAS-STING信号被成功阻断，并且CIN也无法激活。

此外，Reversine诱导野生型BT549细胞CIN后，细胞生存能力不受明显影响；但是，此时如果敲除cGAS基因，CIN-BT549细胞的生存能力将显著减弱。这表明BT549细胞耐受CIN并生存的过程依赖cGAS信号：

研究者通过cGAS/STING-KO株、cGAS抑制剂（RU.521）等，结合体内外实验，证明Reversine/AZD1775诱导CIN过程中BT549细胞的生存是依赖cGAS/STING信号的：

探索机制

为了进一步探索CIN-cGAS-STING轴的下游，研究者首先观察了cGAS-STING的经典下游，主要是转录因子IRF3/STAT1/STAT3等的活性变化。首先，Western Blot检测表明诱导CIN后BT549细胞的cGAS-STING下游信号显著增强：

利用cGAS KO/STING KO的细胞系，研究者还进一步表明Reversine促进STAT1/STAT3/IRF3磷酸化的过程依赖cGAS-STING信号，缺少cGAS/STING只能引起较弱甚至是无反应：

此外，研究者基于RNS-Seq进一步挖掘Reversine诱导CIN后抑制cGAS信号时下游分子/通路的改变，发现Reversine诱导BT549细胞的CIN后，cGAS KO介导的IFN–STAT1–STAT3信号减弱比TNF–NF-κB信号更加显著：

这个技巧可以学习一下

在附图里作者列出更加详细的分析（从基因、hallmarks基因集、TF调节3个方面分析。主要是相对定性地比较。注意作者的实验设计）：

由于CIN肿瘤中cGAS信号缺失会较大地影响IFN–STAT1–STAT3信号，研究者将注意力放在STAT1和STAT3在肿瘤细胞耐受CIN中的具体作用。实现表明STAT1 KO虽不直接影响肿瘤细胞的活性，但STAT1 KO后cGAS KO的CIN增敏效应将不存在；STAT3 KO虽可导致肿瘤细胞对CIN敏感，程度与cGAS KO类似；但两者无明显的协同效应。这表明cGAS-KO所介导的Reversine治疗敏感依赖STAT1激活而不依赖STAT3？

此外，研究者们构建了具有不同活性STAT1突变体的Dox诱导表达模型，发现STAT1^Y701E（持续活化型）过表达能在更大程度上增强cGAS KO或STAT3 KO细胞对CIN的敏感性，并表现出剂量依赖性；而STAT1^Y701A（不可磷酸化型）则无此效应。这些结果更进一步地证实STAT1激活增强cGAS KO肿瘤细胞对CIN敏感性的重要作用：

扩展论证

NF-kB pathway是机制的另外一条线

作者还研究了NF-kB的经典/非经典通路，发现NF-kB经典通路信号的缺失（RelA-KO/TRAF2-KO）并不能增强BT549细胞对CIN压力的敏感性，而NF-kB非经典通路信号的缺失（RelB-KO/NIK-KO）则可增强BT549细胞对CIN压力的敏感性。

研究者发现低剂量ASK1/JNK抑制剂可增强cGAS^KOBT549细胞对CIN压力的耐受，这表明CIN诱导cGAS^KOBT549细胞死亡的过程依赖ASK-JNK信号：

As CIN induces RELB signalling in our model systems (Fig. 1g) and we previously found that CIN-induced TNF–NF-κB signalling can induce apoptosis through ASK–JNK signalling 28 , we next investigated whether inhibition of ASK or JNK would prevent MPS1 and WEE1 inhibitor-induced cell death of cGAS KO BT549 cells. High doses of either the ASK1 and JNK inhibitors NQDI-1 and SP600125, respectively, were toxic to wild-type and cGAS KO cells. By contrast, lower doses of the ASK and JNK inhibitors rescued MPS1 and WEE1 inhibitor-induced cell death in cGAS KO cells (Fig. 1k and Extended Data Fig. 6j–l), which indicates that the cell death observed in CIN-induced cGAS KO cells involves ASK–JNK signalling.

扩展论证2

选同类细胞将流程再走一遍。

除了BT549外，研究者还利用另外一株TNBC细胞——4T1细胞复现了Reversine/AZD1775诱导的CIN压力下的细胞生存依赖于cGAS-STING信号：

同时，体内外实验和通路分析也表明，cGAS信号缺失可引起相应下游改变并使4T1细胞对急/慢性CIN敏感：

cGAS-STING信号缺失还可引起CCL5、CXCL10（既往研究表明它们是cGAS-STING调节细胞因子）的表达下调：

cGAS-STING诱导的IL-6–IL-6R–STAT3信号是CIN型TNBC生存所必需的

STAT1激活在临床上可能不具备操作性，所以作者就研究STAT3通路那边，所以就想到要搞搞IL-6-IL-6R通路？而且IL-6R有FDA-approved drugs，临床转化潜能更强

明确靶点2

通过差异性基因分析，作者发现Reversine处理后细胞IL6表达水平上调（Reversine vs. WT）：

这个geom说实话不太合理，实心点属于Cytokine还是cGAS-dependent呢？

cGAS/STING/RELB基因的KO或DKO后，BT549的活性并不依赖于IL-6；但在Reversine诱导CIN所致BT549细胞活性下降时，使用>0.8ng/ml IL-6即可回复BT579的活性，这表明cGAS/STING信号缺失后，CIN诱导BT549细胞活性下降的过程依赖于IL-6：

扩展论证3

作者还检测了另外一个STAT3信号相关的细胞因子IFNα，结果类似于IL-6，低浓度重组IFNA2可增强cGAS KO细胞在CIN压力下的生存能力。高浓度IFNA2可能通过高度激活STAT1从而促进细胞死亡。

基于多个TNBC细胞系（BT549, MDA-MB-231, MDA-MB-436, E0771）和IL-6信号抑制剂Tocilizumab的体外实验表明IL-6 blockade可增强cGAS信号缺失肿瘤细胞对CIN的敏感性，而非CIN肿瘤细胞则无此效应：

扩展论证4

主要在诱导CIN这个点玩花样，通过操纵MCAK基因构建慢性CIN-high/low细胞模型

对于CIN-high（dnMCAK OE）、CIN-low（KIF2C OE）的4T1肿瘤细胞的研究也表明IL-6 blockade可增强cGAS信号缺失肿瘤细胞对CIN的敏感性：

类似的，CIN-high肿瘤的核周STING水平、pSTAT1^Y701水平均高于CIN-low肿瘤：

抑制IL-6R可损害CIN型TNBC的生长

体内实验验证一波

靶向治疗

研究者通过体内实验证明CIN-high肿瘤对于IL-6R blockade治疗十分敏感：

扩展论证5

进一步对TCGA-BRCA数据分析表明在很多ER/PR/Her2阴性、低IFN-γ信号（所谓的Immune-cold）的肿瘤样本中，有相当部分的IL-6信号较强。这个结果暗示IL-6 blockade治疗在ER/PR受体阴性、低IFN-γ信号肿瘤中或有一定的应用前景。

针对TCGA-BRCA亚组的生存分析结果表明：在高倍性/高CIN状态的患者中，肿瘤组织IL-6信号较强的患者预后甚至比immune-cold更差。

是不是可以在泛癌队列里分析一波，看看有什么分子可以和IFN signaling/Aneuploidy相互独立地影响预后？

抗IL-6治疗的泛癌普适性

在泛癌水平上推广结论。

扩展论证6

为了进一步评估CIN与IL-6在其它肿瘤的普适性，研究者观察了CCLE的数据，根据预测初步锁定数个在CIN状态时对抗IL-6信号治疗敏感/耐受的细胞株：

这个预测的标准是什么？

qPCR进一步验证：

进一步的Tocilizumab药敏实验也进一步佐证了预测的结果。比如，NCI-H1975、OVCAR3、A375、SKMEL28在CIN状态下确实对IL-6R blockade不太敏感：

作者利用HCC827细胞进一步在体内研究CIN与IL-6R blockade的关系：

自发T-ALL

通过Mad2 ^fl/fl/Mps1 ^fl/fl ;Trp53 ^fl/fl ; Lck-cre鼠构建CIN型急性T细胞白血病动物模型，通过单细胞测序的Chromosome copy number分析表明，模型鼠显示出与慢性CIN一致的高度非整倍体和核型异质性，与之对应的Msh2 ^–/– T-ALL cells则无CIN（eT）：

体外实验表明在与原始的、非CIN性T-ALL小鼠肿瘤细胞相比，CIN性T-ALL小鼠的肿瘤细胞对Tocilizumab治疗敏感：

小结

创新性

本文主要论证了靶向cGAS-STING信号在CIN肿瘤中的有效性及具体机制，并挖掘出IL-6/IL-6R信号可作为靶向STAT1/STAT3下游信号的共同靶点，加速了临床上通过阻断IL-6信号治疗CIN肿瘤治疗的进程。

本研究反映了过去20年生物医学技术快速发展的阶段性成果之一。至少在10年前（甚至可能更早），基于二代测序和bulk组织大数据为核心的高通量泛癌研究已经发现CIN型肿瘤并归纳了其基本特征。所以CIN型肿瘤并不是一个新的发现。比如在胃癌中，除了CIN型，常见的分子分型还包括MSI型、EBV型和GS型。不过，当时人们还不清楚这些分型如何指导肿瘤患者的临床治疗——因为它们通常是关于肿瘤基因组的宏观描述，并不是某个简单的单基因突变。后来，随着免疫检查点抑制剂（ICIs）在肿瘤治疗领域大放异彩，人们发现EBV型和MSI型肿瘤对于ICIs治疗特别敏感，这可能与较高的肿瘤突变负荷（TMBs）导致的肿瘤的高免疫原性有关（当然具体的机制也仍在研究当中）。针对MSI或CIN肿瘤的特异性疗法让肿瘤分子分型焕发出新的生命力，与它们相关的系列研究正在逐渐地影响着临床治疗决策。

与传统的分子生物学研究不同，分子分型其实比较依赖于现代计算机技术、高能量测序技术、生物大数据（特别是real-word data）及其算法等新型技术的突破。继2015年前后，近期（2022年）Nature再次推出一些CIN、CNV的泛癌研究，估计是大佬们在肿瘤组学研究中又有一波新的大发现，拿到全文后有机会再向童鞋们介绍。另外，我也完全相信诸如Single Cell Sequencing之类的新技术会在未来更加深刻地改变生物医学的研究。

值得一提的是，cGAS-STING信号通路的发现也蛮久远了；而且首先发现也不是在肿瘤领域，而是研究微生物性疾病和细胞天然免疫研究领域。在过去20年里，cGAS-STING信号的机制研究得也比较透彻，cGAS-STING-I型IFN/NF-κB轴的机制算是比较经典。从这个角度上看，本研究创新的点其实并不多。我估计将IL-6R blockade治疗肿瘤的研究应该很多，但指明在CIN型肿瘤对IL-6R blockade治疗敏感的研究应该不多，所以它确实是一项有望改写临床指南的研究。再加上夯实的实验验证，其发表在CNS上也不太令人惊讶。

实验设计

我估计作者很早就确定了这个文章的框架，至少有一些IL-6R blockade治疗CIN肿瘤的体外实验结果就已经确定了。在机制研究上，本文确实没有很多新的点；但这篇论文的临床转化能力确实太强，毕竟IL-6R抑制剂——Toclizumab可是一款正儿八经的FDA-approved药物！只不过之前的适应症是类风湿关节炎、全身性幼年特发性关节炎（SJIA）、多关节幼年特发性关节炎（PJIA）、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征、系统性硬化症相关间质性肺病之类的自身免疫性疾病，还没有肿瘤适应症。此文一出，抗IL-6治疗的适应症又有可能要扩展了，如果临床实验的结果好的话，说不定这事就成了！Genentech公司的主管看到这个研究估计睡觉都要笑醒了。总之，我觉得本文特点可以这样总结：不好意思，临床转化真系大晒！

尽管如此，CNS级别论文实验论证的深度和广度一般都有保障的，也不是一般的文章能比，本文也不例外。比如：

• 诱导CNI肿瘤：作者除了使用Reversine/AZD1775构建急性CIN模型，也通过构建KIF2C/dnMCAK-OE细胞来构建CIN模型。不知道研究CIN肿瘤的人里是不是常规操作。
• 多种细胞：除了多个TNBC，后面还测试了很多其它癌种的细胞。
• 变量控制：多数目标基因使用了knockout甚至是double knockout，在研究STAT1时还使用了Dox诱导的剂量依赖性过表达。
• 机制广度和深度：基于cGAS-STING，机制研究走了STAT1/STAT3两条线，这也是蛮难驾驭的。
• 生物大数据：有部分数据，但个人觉得并不太关键，只是锦上添花的作用。
• 动物模型：移植瘤模型、条件性敲除鼠，CNS常规操作吧，不吹不黑。

总之，这个文章还是有很多值得学习的地方，以后有什么心得再回来补充！