概述

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论文：TCR-Vγδ usage distinguishes protumor from antitumor intestinal γδ T cell subsets. Science. From德国慕尼黑大学医院医学II部、慕尼黑巴伐利亚癌症研究中心的Julia Mayerle团队

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摘要

• γδ T 细胞代表了大部分处于稳态的肠道淋巴细胞，它们构成了浸润结肠直肠癌 (CRC) 的主要淋巴细胞群；然而，它们对 CRC发生或进展的时间贡献仍不清楚。
• 利用人类 CRC 样本和小鼠 CRC 模型，研究者们发现癌前或非肿瘤结肠中的大多数 γδ T 细胞表现出细胞毒性标志物，而肿瘤浸润性 γδ T 细胞则表现出致瘤性特征。这些对比鲜明的 T 细胞谱与人类和小鼠中不同的 T 细胞受体 (TCR)-Vγδ 基因使用有关。
• 纵向交叉遗传学和抗体依赖性策略表明：靶向稳定状态下富集在上皮细胞中的鼠 γδ T 细胞导致肿瘤发展加剧，而靶向在 CRC 期间积累的 γδ 亚群导致肿瘤生长减少。
• 我们的结果揭示了 γδ T 细胞亚群在时间上的促肿瘤和抗肿瘤作用。

前言

这个文章的解读其实比较早就开始了，只是中途因其它事情，解读的过程断断续续；再加上作者的研究框架我不太熟悉，所以搞了很久才理解清楚本文的核心观点（也有可能还不完全清楚(～￣▽￣)～，毕竟是CNS级别的论文，还是比较难懂的）。这里我个人有3个建议：

• 阅读本文之前要有一个基本的认识，就是关于研究者如何表征肿瘤发生和肿瘤进展。本文主要有2个自发性肿瘤模型，无论是化学诱导型还是基因型，肿瘤都是经历“无——有——发展”的阶段。研究者通过肿瘤数量来表征肿瘤发生，通过肿瘤大小来表征肿瘤进展。只有把握住这一点，才能理解作者的实验结果如何表征肿瘤发生/发展的不同阶段，也就是所谓的时间特异性。
• 本文在逻辑上一致的实验结果有很多分拆到Supplementary materials里，所以要充分地阅读它们才能比较全面理解研究者的思路。
• 建议阅读正文，这样才能比较好地理解研究者想要表达的观点。
• γδ T细胞和αβ T细胞的功能比较。免疫书上复制过来的(～￣▽￣)～：

差不多是这样。对于T细胞亚型不太熟悉的，可能还要翻翻免疫学复习一下T细胞的章节。另外，我觉得目前解读仍不太完善，以后有机会再多多补充，先把不太完整的解读发出来吧（主要是鸽太久了心里有点不舒服），大伙也帮忙看看，给点意见。GoGoGo!

结果

人CRC发现组织特异性γδ T 细胞亚群

研究者的思路比较朴素，即通过测量（单细胞测序）临床患者的肿瘤组织、癌旁组织的γδ T 细胞亚群，发现有些γδ T细胞亚群具有促癌性分子特征，有些γδ T细胞亚群却具有抑癌性分子特征。在本文中，抑癌性γδ T细胞亚群主要是IL-17⁺的。

利用从CRC术后患者的肿瘤组织和癌旁正常肠黏膜组织，通过流式筛选出CD3⁺SytoxBlue^–γδ⁺细胞：

针对癌vs.癌旁的γδ T 细胞进行单细胞测序，发现了10个不同的亚群：

通过GSEA分析，发现肿瘤组织的γδ T 细胞的STAT信号 、脂质代谢合成、细胞因子信号等通路基因表达上调，而IFN信号、TNFα信号等抗肿瘤通路基因表达下调：

肿瘤组织γδ T 细胞主要属于2/5类（产IL-17），而正常组织主要是0/1类（产IFN-γ）。克隆分析结果表明第5类 γδ T细胞的Vγ4基因（TRGV4）表达较高：

促癌/抑癌性γδ T 细胞亚群共存于CRC中

由于在临床中观察到CRC患者肿瘤组织中促癌/抑癌性γδ T 细胞亚群的共存状态，研究者进一步通过两种不同的自发性CRC小鼠模型以进一步验证和复现临床分子特征的改变，主要是需要观察癌变过程中γδ T 细胞亚群的功能状态变化。研究者们还发现促癌/抑癌性的共存状态在γδ T细胞中比较明显，而CD4⁺细胞中则不太明显。

在原始小鼠中，结直肠黏膜的γδ T细胞主要表达Vγ1和Vγ7，很少表达Vγ4和Vγ6。为了进一步了解γδ T 细胞亚群与CRC的关系，研究者建立了两种结直肠癌模型——化学诱导型（AOM-DSS性肠炎）和基因型（Cdx2^ERApc^F/F或称Cdx2^Cre-ER x APC^fl/fl、iCdx2^△APC + tamoxifen诱导）：

在AOM-DSS结直肠癌模型中，肿瘤组织中γδ T细胞中IFNγ⁺、CD107⁺IFNγ⁺、IL-17⁺细胞占比均高于正常组织。而另一大亚群——CD4⁺ T细胞中IFNγ⁺、CD107⁺IFNγ⁺、IL-17⁺细胞占比则无明显差异，这表明γδ T细胞亚群在CRC中的作用可能比CD4⁺ T细胞更加重要：

在tamoxifen治疗iCdx2 ^△APC小鼠的自发CRC模型中，每周检测IELs的CD8或PD-1/IL-17的含量，发现抑癌性的CD8α+的γδ T细胞比例不断下降，而免疫抑制性的PD-1/IL-17阳性γδ T细胞比例却不断上升：

在AOM-DSS结直肠癌模型也有类似的结果：

在tamoxifen治疗iCdx2 ^△APC小鼠的自发CRC模型中，PD-1⁺肿瘤浸润γδ T细胞的IFN-γ水平较低，而IL-17水平较高，表现出免疫抑制状态：

在AOM-DSS模型中的结果也是类似的：

在tamoxifen治疗iCdx2 ^△APC小鼠的自发CRC模型中，肿瘤组织的γδ T细胞的IL-17、PD-1水平高于正常组织，IFNγ水平也高于正常组织；CD8α的水平则相当；肿瘤组织的CD4⁺ T细胞的IFNγ水平有所下降、IL-17水平有所上升，但这种差异并不显著。此外，无论是正常组织还是肿瘤组织，γδ T细胞的IL-17水平均远高于TCRβ⁺CD4⁺细胞：

在AOM-DSS模型中，γδ T细胞进一步细分为CD8a⁺ PD-1⁻和CD8a⁻ PD-1⁺ 两个亚群。RNA-Seq的结果表明，CD8a⁺ PD-1⁻亚群高表达细胞毒性基因，CD8a⁻ PD-1⁺ 亚群则高表达 IL-17相关基因，进一步佐证了部分γδ T细胞的处于免疫抑制状态：

在AOM-DSS模型中，肿瘤vs.正常组织的scTCR-seq结果表明TCR分布的显著差异。在肿瘤前病变向肿瘤发展的过程中，Vγ6类TCR比例大幅升高，而Vγ1/7类TCR比例则有所下调：

流式的结果也进一步表明：与正常组织相比，肿瘤组织中富含Vγ6 TCR的γδ T细胞，而Vγ7 TCR的γδ T细胞的比例则相对较低：

在IL-17/PD-1阳性（免疫抑制性）的肿瘤浸润γδ T细胞中，Vγ6 TCR水平极高；而在IFNγ阳性（免疫活性）的肿瘤浸润γδ T细胞中几乎检测不到Vγ6，这提示Vγ6与γδ T细胞的抑制性功能密切相关：

上皮定植Vγ1⁺和Vγ7⁺ γδ T细胞的失活/清除导致肿瘤数量增加

Trdc^-/-小鼠具有γδ T细胞的功能缺陷，是一个常用的动物模型。研究团队既往研究表明上皮定植的γδ T细胞控制早期侵袭的过程依赖于Glut1（即Slc2a1）。由于Trdc^-/-小鼠对DDS比较敏感，研究者还观察了DSS低剂量（1%）对小鼠成瘤的影响。研究者还通过Vγ7基因编辑、anti-Vγ1直接观察γδ T细胞的抗肿瘤效应。作者主要的结论是小鼠肠上皮定植的Vγ1⁺和Vγ7⁺ γδ细胞对肿瘤形成的早期控制具有重要作用。

γδ T细胞失活对肿瘤发生、发展的作用

为了评估上皮滞留γδ T细胞是否参与CRC的限制，通过品系杂交构建iTrdc^Slc2a1fl/+小鼠（单倍失活）、iTrdc^△Slc2a1（二倍失活）小鼠和同窝对照组小鼠 (iTrdc^Slc2a1+/+ ) ，通过AOM-DSS喂养构建结直肠癌模型。低剂量DSS对Trdc^-/-小鼠基本不成瘤：

与对照组相比，γδ T细胞存在Slc2a1缺陷的小鼠的体重更轻，且肿瘤数量更多、肿瘤负荷更重。值得注意的是，Slc2a1的单/二倍失活之间的差异并不显著：

无论γδ T细胞中Slc2a1的功能状态如何，与正常组织相比，肿瘤组织中γδ/αβ T细胞的比例均有所下降；且γδ T细胞的Vγ7水平也有所下降。不过，αβ T细胞的CD8αβ及IFNγ水平在肿瘤和正常组织中的分布并无明显差异（因为基因编辑未干预到αβ细胞且其与肿瘤发展的关系并不密切）：

这3组小鼠肿瘤/非肿瘤组织的浸润γδ T 细胞分析表明：与正常组织相比，肿瘤浸润γδ T 细胞的CD8α水平较低，而PD-1、IFN-γ、IL-17表达较高。此外，γδ T 细胞的Slc2a1功能缺陷程度与IFN-γ表达水平呈正相关，与IL-17表达水平呈负相关，这表明γδ T细胞的抗肿瘤功能亚群的发展依赖Slc2a1：

Vγ1⁺/Vγ7⁺ γδ T细胞的作用

为了直接评估上皮定植γδ T细胞的抗肿瘤作用，构建Vγ7转基因小鼠模型（对照、单倍缺失、二倍缺失）。脂肪组织、大肠上皮、皮肤和肝脏的TCRαβ细胞的Vγ进行检测证明了建模有效性：

为什么脂肪组织没有Vγ7的测量数据？

在Vγ7^+/+、Vγ7^+/-和Vγ7^-/-的小鼠中通过AOM-DSS策略建立CRC模型，发现Vγ7水平对肿瘤数量和肿瘤大小无明显影响，尽管Vγ7^-/-小鼠肿瘤中的γδ T细胞比例显著降低。这表明Vγ7对CRC的肿瘤发生和肿瘤进展无显著影响：

对Vγ7^+/+、Vγ7^+/-和Vγ7^-/-小鼠的肿瘤进行Vγ检测后发现，在正常组织中，Vγ7缺失可导致γδ T细胞的CD8αα、CD4⁺ αβ T细胞的IL-17的水平下降，但在肿瘤组织中无显著影响。在肿瘤组织中，Vγ7缺失可抑制αβ T细胞的Vγ4/6表达，但在正常组织中无显著影响。（？）：

在Vγ7^+/+、Vγ7^+/-和Vγ7^-/-的小鼠中进行anti-Vγ1治疗时，无论是肿瘤或者是正常组织，Vγ7状态对CD4⁺ αβ T细胞、CD8αβ⁺ αβ T细胞的IFN-γ或IL-17水平均无明显影响：

在Vγ7^+/+、Vγ7^+/-和Vγ7^-/-的小鼠中进行anti-Vγ1治疗，发现Vγ7缺失小鼠的肿瘤数目更高，而平均肿瘤大小无明显差异；Vγ7缺失后，肿瘤组织的γδ TCR、Vγ1相对含量有所下降，而Vγ4和Vγ6则无明显影响。结合之前的实验，这表明Vγ1⁺和Vγ7⁺ γδ T细胞共同参与对肿瘤发生的抑制作用：

进行anti-Vγ1治疗时，Vγ7^+/+或Vγ7^+/-小鼠正常组织中γδ T细胞的CD8αα水平高于Vγ7^-/-组小鼠，PD-1水平则低于Vγ7^-/-组小鼠；而在肿瘤组织中，Vγ7^+/+、Vγ7^+/-或Vγ7^+/-小鼠的抗肿瘤/促肿瘤细胞因子的水平并无明显差异。这在分子水平上表明Vγ1/Vγ7 γδ T细胞主要在肿瘤早期阶段对肿瘤具有限制作用：

IL-17⁺ γδ T 细胞促进肿瘤生长的过程依赖微生物组和TCR

之前的研究发现了影响肿瘤发生的γδ T细胞亚群（Vγ1⁺/Vγ7⁺）。这部分主要是证明影响肿瘤进展的γδ T细胞亚群是Vγ4⁺/Vγ6⁺（分泌IL-17）。

IL-17+ γδ T细胞的促肿瘤作用

因为Rorγt是T细胞生产IL-17的主要细胞因子，所以通过对Rorγt基因和Trdc基因的基因编辑可以构建研究IL-17⁺ γδ T功能的小鼠模型——iTrdc^△Rorc（双倍体失活）和iTrdc^{Rorc fl/+}（单倍体失活）。利用tamoxifen腹腔注射构建自发性肿瘤模型，研究者发现iTrdc^△Rorc小鼠肿瘤大小显著小于对照组iTrdc^{Rorc fl/+}，这表明IL-17⁺ γδ T细胞可促进肿瘤进展，但对肿瘤发生无明显影响：

与对照组iTrdc^{Rorc fl/+}相比，iTrdc^△Rorc小鼠肿瘤中的γδ T细胞的Vγ7比例大幅上调，同时伴有Vγ4/6比例的下调。在肿瘤组织中，iTrdc^△Rorc小鼠 γδ T细胞的CD8α水平与对照组相比无明显差异；但PD-1和IL-17水平则大幅降低。在肿瘤组织中，iTrdc^△Rorc小鼠 CD4⁺ αβ T细胞的CD8αβ和IL-17的水平与对照组iTrdc^{Rorc fl/+}相比无明显差异：

肠道菌群诱导Vγ6+ γδ T细胞的促肿瘤作用

接下来，为了研究肠道菌群对γδ T细胞功能的影响，研究者们使用了APC基因编辑模型（iCdx2^△APC小鼠）而不是DSS化学诱导模型（DSS喂养对肠道菌群的影响比较复杂）。利用iCdx2^△APC小鼠进行tamoxifen腹腔注射构建自发性CRC模型，研究者对模型小鼠粪便颗粒的16S rRNA测序分析发现，随着时间的推移，iCdx2^△APC小鼠和对照组小鼠的肠道菌群分布差异逐渐显著，这表明CRC发展过程中肠道菌群分布在发生显著变化：

在第3-5周，通过水服抗生素复合制剂（ABX）清除iCdx2^△APC小鼠的肠道微生物。与对照组相比，喂养ABX的小鼠肿瘤体积有所减小，但肿瘤数目和肿瘤负荷无明显差别，这表明肠道微生物介导的抗肿瘤效应发生在肿瘤发展的较晚期：

喂养ABX后，iCdx2^△APC小鼠的肿瘤浸润TCRαβ⁺ CD8αβ⁺ T细胞的IFN-γ水平有所上调：

针对iCdx2^△APC小鼠γδ T细胞进行流式检测，发现喂养ABX后，无论是正常组织还是肿瘤组织，γδ T细胞的CD8α水平均显著上调，且PD-1和IL-17水平均下调，而此改变主要发生在Vγ6⁺ γδT细胞中。这表明肠道菌群促进了Vγ6⁺ γδT细胞的促肿瘤功能态，肠道菌群清除可导致促肿瘤Vγ6⁺ γδT细胞的促肿瘤功能大幅减弱：

体内EdU+流式的分析表明：肿瘤组织Vγ6⁺ γδT细胞增殖能力比Vγ6^– γδT细胞更强，但喂养ABX后Vγ6⁺ γδT细胞增殖能力减弱：

针对TCR类型的研究发现ABX对Vγ4 γδT细胞的浸润水平无显著影响：

上述实验结果从多个角度表明：肠道菌群可通过调控Vγ6⁺ γδT细胞功能影响肿瘤生长。

靶向TCRγδ的抗肿瘤潜力

为了评估靶向TCRγδ调控肿瘤生长的潜力，研究者们在实验最后两周的小鼠每周给予两次anti-TCRγδ治疗。研究者们发现，anti-TCRγδ治疗对降低成瘤数量、成瘤体积和肿瘤负荷均有显著效果：

与之对应的，肿瘤浸润γδT细胞的CD8α水平显著上升（尽管伴随INF-γ水平一定程度下降），并且PD-1/IL-17水平均有所下调（特别是IL-17）：

另外，体内EdU+流式的分析表明：anti-TCRγδ治疗明显抑制γδT细胞的增殖，并且不依赖其PD-1水平：

在不同周数观察肿瘤组织中TCRγδ分布，发现肿瘤发展过程中TCRγδ水平不断下调，而anti-TCRγδ治疗后其分布明显上调？

是不是有点矛盾？看细点。

此外，作者还测试了在Tamonxifen注射早期（w-1~w1）的阶段给予anti-TCRγδ治疗，发现肿瘤数量、肿瘤大小、肿瘤负荷均无明显差异，说明anti-TCRγδ对Tamonxifen诱导的肿瘤发生没有显著影响。同时，早期使用anti-TCRγδ治疗对γδ/αβ T细胞比例、γδ T细胞的CD8α、PD-1、EdU、IFN-γ、IL-17表达水平均无明显影响；不管PD-1状态如何，早期使用anti-TCRγδ治疗对对CD4+ T细胞增殖无明显影响：

Vγ6⁺和Vγ4⁺ γδ T细胞分泌IL-17⁺并促进肿瘤生长

之前的研究表明靶向Vγ6⁺/Vγ4⁺ γδ T细胞可能具有抑制肿瘤发生的作用。这部分实验证明，只有同时靶向Vγ6和Vγ4才可以发挥抑制肿瘤发生的作用，而仅靶向Vγ6并不能抑制早期肿瘤的形成。

仅靶向Vγ6对肿瘤进展无明显影响

构建Vγ4^−/−小鼠模型，并对脂肪、大肠、肺、肝等组织进行Vγ亚型检测以检证模型有效性：

构建Vγ6^−/−小鼠模型，并对脂肪、大肠、肺、肝等组织进行Vγ亚型检测以检证模型有效性：

基于成功构建的Vγ6^+/-和Vγ6^-/-小鼠，利用AOM-DSS建立自发性肿瘤模型。研究者们发现，Vγ6^-/-的肿瘤数目和肿瘤负荷略高于Vγ6^+/-小鼠：

为什么分组中没有纳入Vγ6^+/+小鼠呢？

无论在肿瘤还是正常的肠黏膜组织，Vγ6^+/-和Vγ6^-/-小鼠的浸润γδT细胞比例并无明显差异。不过，与Vγ6^+/-小鼠相比，Vγ6^-/-小鼠的肿瘤浸润γδTCR的Vγ4水平显著上调。流式的结果表明，Vγ6缺失对肿瘤浸润γδT细胞的CD8α和IFN-γ水平无明显影响，也仅轻微地下调PD-1和IL-17水平：

类似的，在IL-17⁺的肿瘤浸润γδT细胞中，Vγ6缺失也可显著地上调Vγ4的表达：

靶向Vγ4和Vγ6抑制肿瘤进展

为了进一步评估靶向Vγ4的抑制肿瘤发生的效应，研究者们在第二次DSS周期后每周给予anti-Vγ4治疗。结果表明，与Vγ6部分缺失相比，Vγ6完全缺失时anti-Vγ4治疗可以减小成瘤数量、大小及负荷：

机制上，与Vγ6^+/-小鼠相比，Vγ6^-/-小鼠接受anti-Vγ4治疗可诱导肿瘤γδT细胞浸润减少：

流式的结果表明，与Vγ6^+/-小鼠相比，Vγ6^-/-小鼠接受anti-Vγ4治疗可以上调肿瘤γδT细胞的CD8α表达（对INF-γ水平无明显影响），且极大地下调PD-1和IL-17表达：

类似的，在IL-17⁺的肿瘤浸润γδT细胞中，anti-Vγ4治疗可显著抑制Vγ4表达，此效应不依赖Vγ6状态：

小结

本研究的主要创新点在于一个反经验的发现——即γδ T细胞对肿瘤作用的时间特异性。具体而言，即Vγ1/7 γδ T细胞调控肿瘤发生，而Vγ1/6 γδ T细胞调控肿瘤进展。γδ T细胞的功能状态似乎非常复杂多变，细胞-细胞相互作用也比较复杂，并且还与肠道菌群有密切关系（研究者们也没有确定具体哪个株参与γδ T细胞调控肿瘤的过程）。发现比较意外，留的坑也不小。在实验设计方面，作者发现γδ T细胞异质性的单细胞研究框架是比较普通的，没有什么特别的分析。测量T细胞功能主要依赖流式分选和流式细胞技术，在表征T细胞状态的过程也是使用经典的细胞毒性分子或免疫检查点分子，对具体通路没有特别研究（可能是比较明确；或者研究者觉得这个角度没有必要花很多心思去研究）。本研究所使用的动物模型多为转基因鼠，且是诱导自发肿瘤，动物实验的周期是比较长的（也比较贵），估计只有比较有钱、基础扎实的课题组才玩得起。作者发现γδ T细胞异质性的起点其实是基于单细胞测序的亚群分析，这个新技术在近来的CNS文章中已经成为“常规”技术（据我所知是个很烧钱的东西）。研究者表征肿瘤发生和肿瘤进展的思路还是很巧妙的，值得学习。

不过我也有几个点不太理解。比如，研究者在探究IL-17功能时为什么不使用IL-17转基因鼠，而要使用Rorγt转基因鼠呢？尽管Roryt是IL-17表达的关键调控转录因子，但也不排除Rorγt可能还参与了其它分子的调控。这在逻辑上似乎不是很严密。也许是Rorγt转基因鼠他们刚好有，或者Rorγt转基因鼠本来就是一个成熟的观察IL-17的模型？另外，研究者也构建了Vγ4转基因小鼠，但是没有看到与其相关的实验数据，不知道是不是漏了。最后，我觉得靶向γδ T细胞（亚群）的治疗策略在动物实验上的表现并不太惊艳，感觉临床转化的价值不高（估计基础研究的价值比较高吧）。